Лі народився в Атланті, штат Джоржія. Народився у родині Жаклін Керол (до того Шелтон), вчительки мистецтв і чорної літератури, і Вільяма Джеймса Едварда Лі ІІІ, джаз-музиканта і композитора. Лі має три молодших брата і сестри, Джоі, Девіда й Сінк, вони всі працюють на тих чи інших позиціях в кіно брата. Режисер Малкольм Д. Лі — кузен Спайка Лі. Ще дитиною він з родиною переїхав до Брукліна, штату Нью-Йорк. Це мама дала йому прізвисько «Спайк». Він ходив до John Dewey High School в Брукліні.
Лі записався у Morehouse College, історично чорний коледж, де він зробив свій перший фільм, Last Hustle in Brooklyn. Він відвідував кінокурси в Університеті Кларка в Атланті, випустився як бакалавр масової комунікації з Коледжу Моргауз. Він також випустився зі Школи мистецтв Тіша Нью-Йоркського Університету, де й став маґістром з кіно і телебачення.
